Продукты

Фосфорилирование белков регулирует различные клеточные функции и играет ключевую роль в раннем развитии растений.Чтобы дополнить и расширить предыдущие исследования фосфорилирования белка в проростках арабидопсиса, мы использовали альтернативный подход, который сочетает экстракцию белка в неденатурирующих условиях с аффинной хроматографией с иммобилизованными ионами металлов (IMAC) с обогащением интактных фосфопротеинов в экстрактах, обедненных Rubisco, с последующей идентификацией. с использованием двумерного гель-электрофореза (2-DE) и жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (LC-MS/MS).Расщепление трипсином в геле и анализ выбранных пятен геля выявили 144 фосфорилированных пептида и остатка, из которых только 18 фосфопептидов и 8 фосфозитов были обнаружены в базах данных фосфорилирования PhosPhAt 4.0 и P3DB Arabidopsis thaliana.Более половины из 82 идентифицированных фосфопротеинов были вовлечены в углеводный обмен, фотосинтез/дыхание или механизм реакции на окислительный стресс.Обогащение интактных фосфопротеинов перед 2-DE и LC-MS/MS, по-видимому, улучшает обнаружение фосфорилированных остатков треонина и тирозина по сравнению с методами, использующими обогащение на уровне пептидов, что позволяет предположить, что эти два подхода в некоторой степени дополняют друг друга с точки зрения охвата сайтов фосфорилирования.Сравнение результатов для молодых проростков с результатами, полученными ранее для зрелых листьев арабидопсиса, выявило пять белков, которые по-разному фосфорилируются в этих тканях, что демонстрирует потенциал этого метода для исследования динамики фосфорилирования белков в процессе развития растений.