Продукты

Эукариотические клетки содержат тонкий баланс мельчайших количеств четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dNTP), достаточный лишь для нескольких минут репликации ДНК.Как дефицит, так и избыток одного dNTP может привести к увеличению частоты мутаций, нарушению репарации ДНК или истощению митохондриальной ДНК.dNTP обычно количественно определяют с помощью ферментативного анализа, в котором включение радиоактивного dATP (или радиоактивного dTTP в анализе dATP) в специфические синтетические олигонуклеотиды с помощью ДНК-полимеразы пропорционально концентрации неизвестного dNTP.Мы обнаружили, что обычно используемая ДНК-полимераза Кленова может заменить неизвестный dNTP соответствующим рибонуклеотидом, что в некоторых случаях приводит к значительному переоценке dNTP.Теперь мы опишем условия анализа для каждого dNTP, которые позволяют избежать включения рибонуклеотидов.Для анализов дТТФ и дАТФ достаточно минимизировать концентрации фермента Кленова и меченого дАТФ (или дТТФ);для dCTP и dGTP нам пришлось заменить фермент Кленова либо ДНК-полимеразой Taq, либо термосеквеназой.Мы предполагаем, что в некоторых более ранних отчетах включение рибонуклеотидов могло быть причиной слишком высоких значений dGTP и dCTP.