Продукты

Для специфического количественного определения нескольких метаболитов 5-фторурацила (5-ФУ) и двух эндогенных монофосфатных нуклеотидов мы разработали оригинальный метод, основанный на жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС).Этот анализ позволил определить: (i) внутриклеточную продукцию 5-фтор-2'-дезоксиуридин-5'-монофосфата (5-FdUMP) из 5-FU или 5-фтор-2'-дезоксиуридина (5-FdUrd). , (ii) влияние концентрации 5-FdUMP на внутриклеточное соотношение 2'-дезоксиуридин-5'-монофосфата (dUMP)/тимидин-5'-монофосфата (TMP) и (iii) степень секреции 5-FdUMP и 5-ФУ из культивируемых клеток человека транспортерами ABC.В наших экспериментальных условиях клетки инкубировали с 5-FU или 5-FUrd.Затем клеточные белки осаждали метанолом.Эта процедура обеспечила высокую степень извлечения экстракции.Кроме того, для измерения секреции 5-ФУ и 5-ФдУМФ из клеток мы провели количественную оценку этих молекул в культуральной среде.Среду либо вводили напрямую (5-FU), либо подвергали твердофазной экстракции с использованием картриджа для экстракции Oasis Wax (5-FdUMP).Разделение аналитов проводили на колонке dC18 Atlantis 3,5 мкм (100 мм × внутренний диаметр 2,1 мм) в изократическом режиме с использованием буфера формиата аммония/метанола/воды (5/5/90, об./об.) в качестве подвижной фазы.Время выполнения не превышало 6,2 мин.Аналиты ионизировали на границе раздела электрораспыления в режиме отрицательных ионов.Мы валидировали метод в диапазоне 2,5–150 нг/мл в зависимости от соединений.Вариабельность внутри и между анализами была ниже 10% в течение семи дней.Все соединения были стабильны в клетках или в культуральной среде при хранении образцов при температуре -20 °C не менее двух недель и после трех циклов замораживания-оттаивания.В обеих средах матричный эффект не наблюдался.