IPTG (изопропил-β-D-тиогалактозид) является аналогом субстрата β-галактозидазы, который обладает высокой индуцируемостью.При индукции IPTG индуктор может образовывать комплекс с белком-репрессором, так что конформация белка-репрессора изменяется, так что он не может быть объединен с геном-мишенью, и ген-мишень экспрессируется эффективно.Так как же определить концентрацию ИПТГ во время эксперимента?Чем больше, тем лучше?
Во-первых, давайте поймем принцип индукции IPTG: лактозный оперон (элемент) E. coli содержит три структурных гена, Z, Y и A, которые кодируют β-галактозидазу, пермеазу и ацетилтрансферазу соответственно.lacZ гидролизует лактозу на глюкозу и галактозу или на алло-лактозу;lacY позволяет лактозе из окружающей среды проходить через клеточную мембрану и проникать внутрь клетки;lacA переносит ацетильную группу от ацетил-КоА к β-галактозиду, что включает устранение токсического эффекта.Кроме того, имеется рабочая последовательность О, стартовая последовательность Р и регуляторный ген I. Код гена I представляет собой белок-репрессор, который может связываться с положением О операторной последовательности, так что оперон (мета) репрессируется и выключен.Существует также сайт связывания белка-активатора катаболического гена - сайт связывания CAP выше инициирующей последовательности P. Последовательность P, последовательность O и сайт связывания CAP вместе составляют регуляторную область lac-оперона.Кодирующие гены трех ферментов регулируются одной и той же регуляторной областью для достижения скоординированной экспрессии генных продуктов.
В отсутствие лактозы lac-оперон (мета) находится в состоянии репрессии.В это время lac-репрессор, экспрессируемый последовательностью I под контролем последовательности промотора PI, связывается с последовательностью O, что предотвращает связывание РНК-полимеразы с последовательностью P и ингибирует инициацию транскрипции;в присутствии лактозы может индуцироваться lac-оперон (мета). В этой системе оперонов (мета) настоящим индуктором является не сама лактоза.Лактоза поступает в клетку и катализируется β-галактозидазой для превращения в аллолактозу.Последний, как молекула-индуктор, связывается с белком-репрессором и изменяет конформацию белка, что приводит к диссоциации белка-репрессора от О-последовательности и транскрипции.Изопропилтиогалактозид (ИПТГ) действует так же, как аллолактоза.Это очень мощный индуктор, который не метаболизируется бактериями и очень стабилен, поэтому его широко используют в лабораториях.
Как определить оптимальную концентрацию ИПТГ?Возьмем, к примеру, кишечную палочку.
Генетически сконструированный штамм E. coli BL21, содержащий положительный рекомбинантный pGEX (CGRP/msCT), инокулировали в жидкую среду LB, содержащую 50 мкг·мл-1 Amp, и культивировали в течение ночи при 37°C.Вышеупомянутую культуру инокулировали в 10 флаконов с 50 мл свежей жидкой среды LB, содержащей 50 мкг·мл-1 Amp, в соотношении 1:100 для размножающейся культуры, и когда значение OD600 составляло 0,6~0,8, IPTG добавляли до конечной концентрации.Это 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 ммоль·л-1.После индукции при той же температуре и времени из него отбирали 1 мл бактериального раствора, бактериальные клетки собирали центрифугированием и подвергали SDS-PAGE для анализа влияния различных концентраций ИПТГ на экспрессию белка, а затем выберите концентрацию IPTG с наибольшей экспрессией белка.
После экспериментов будет обнаружено, что концентрация ИПТГ не настолько велика, насколько это возможно.Это связано с тем, что IPTG обладает определенной токсичностью по отношению к бактериям.Превышение концентрации также убьет клетку;и вообще говоря, мы надеемся, что чем больше растворимого белка экспрессируется в клетке, тем лучше, но во многих случаях, когда концентрация IPTG слишком высока, будет образовываться большое количество включений.тела, но количество растворимого белка уменьшилось.Таким образом, наиболее подходящая концентрация IPTG часто не тем больше, чем лучше, а чем ниже концентрация.
Целью индукции и культивирования генно-инженерных штаммов является увеличение выхода целевого белка и снижение затрат.На экспрессию гена-мишени влияют не только собственные факторы штамма и экспрессионная плазмида, но и другие внешние условия, такие как концентрация индуктора, температура индукции и время индукции.Поэтому, как правило, перед экспрессией и очисткой неизвестного белка лучше всего изучить время индукции, температуру и концентрацию IPTG, чтобы выбрать подходящие условия и получить наилучшие экспериментальные результаты.
Время публикации: 31 декабря 2021 г.