Продукты

Способ, которым эффекты одновременных мутаций объединяются для изменения ферментативной активности, нелегко предсказать, потому что эти эффекты не всегда линейно аддитивны.Следовательно, характеристика эффектов одновременных мутаций аминокислотных остатков, связывающих субстрат, может внести значительный вклад в понимание субстратной специфичности ферментов.В бета-гликозидазе из Spodoptera frugiperda (Sfbetagly) оба остатка Q39 и E451 взаимодействуют с субстратом, и это важно для определения субстратной специфичности.Двойные мутанты Sfbetagly (A451E39, S451E39 и S451N39) получали сайт-направленным мутагенезом, экспрессировали в бактериях и очищали с помощью аффинной хроматографии.Эти ферменты были охарактеризованы с использованием п-нитрофенил-бета-галактозида и п-нитрофенил-бета-фукозида в качестве субстратов.Отношение k cat/Km для одиночных и двойных мутантов Sfbetagly, содержащих сайт-направленные мутации в положениях Q39 и E451, использовали для демонстрации того, что влияние на свободную энергию ESdouble dagger (комплекс фермент-переходное состояние) двойных мутаций (Gdouble daggerxy) не является суммой эффектов, возникающих в результате одиночных мутаций (Gdouble daggerx и Gdouble daggery).Это различие в Gdouble dagger указывает на то, что эффекты одиночных мутаций частично перекрываются.Следовательно, этот общий эффект засчитывается только один раз в Gdouble daggerxy.Кристаллографические данные бета-гликозидаз показывают наличие бидентатной водородной связи с участием остатков Q39 и E451 и одной и той же гидроксильной группы субстрата.Следовательно, как термодинамические, так и кристаллографические данные свидетельствуют о том, что остатки Q39 и E451 оказывают взаимное влияние на их соответствующие взаимодействия с субстратом.