Продукты

Понимание метаболизма микробного хозяина имеет важное значение для разработки и оптимизации биокаталитических процессов на основе цельных клеток, поскольку оно диктует эффективность производства.Это особенно верно для окислительно-восстановительного биокатализа, где используются метаболически активные клетки из-за регенеративной способности кофактора / косубстрата, эндогенной у хозяина.Рекомбинантную Escherichia coli использовали для сверхпродукции пролин-4-гидроксилазы (P4H), диоксигеназы, катализирующей гидроксилирование свободного L-пролина в транс-4-гидрокси-L-пролин с кетоглутаратом (a-KG) в качестве косубстрата.В этом цельноклеточном биокатализаторе центральный углеродный метаболизм обеспечивает необходимый косубстрат a-KG, связывая биокаталитические характеристики P4H непосредственно с углеродным метаболизмом и метаболической активностью.Применяя как экспериментальные, так и вычислительные инструменты биологии, такие как метаболическая инженерия и анализ (13)C-метаболического потока ((13)C-MFA), мы исследовали и количественно описали физиологический, метаболический и биоэнергетический ответ цельноклеточного биокатализатора. к целевой биоконверсии и определили возможные метаболические узкие места для дальнейшей разработки рационального пути. Штамм E. coli с дефицитом деградации пролина был сконструирован путем удаления гена putA, кодирующего пролиндегидрогеназу.Биотрансформация целых клеток этим мутантным штаммом привела не только к количественному гидроксилированию пролина, но и к удвоению скорости образования специфического транс-4-L-гидроксипролина (hyp) по сравнению с диким типом.Анализ потока углерода через центральный метаболизм мутантного штамма показал, что повышенная потребность в a-KG для активности P4H не увеличивает поток, генерирующий a-KG, что указывает на жестко регулируемую работу цикла TCA в изучаемых условиях.В штамме дикого типа синтез и катализ P4H вызывали снижение выхода биомассы.Интересно, что штамм ΔputA дополнительно компенсировал связанную с этим потерю АТФ и НАДН за счет снижения потребности в энергии для поддержания жизнедеятельности при сравнительно низких скоростях поглощения глюкозы вместо повышения активности трициклической кислоты. быть перспективным для продуктивного катализа P4H не только с точки зрения выхода биотрансформации, но и скорости биотрансформации и поглощения пролина, а также выхода hyp на источнике энергии.Результаты показывают, что после нокаута putA связывание TCA-цикла с гидроксилированием пролина через косубстрат a-KG становится ключевым сдерживающим фактором и мишенью для дальнейшего повышения эффективности зависимых от a-KG биотрансформаций.