Продукты

Новый высокоэффективный жидкостный хроматографический анализ гликозилтрансфераз, основанный на дериватизации антраниловой кислотой и обнаружении флуоресценции.

Анализы были разработаны с использованием уникальной химии мечения 2-аминобензойной кислоты (2AA; антраниловой кислоты, AA) для измерения активности как β1-4-галактозилтрансферазы (GalT-1), так и α2-6-сиалилтрансферазы (ST-6) с помощью высокоэффективной жидкостной хроматография (ВЭЖХ) с обнаружением флуоресценции (Anumula KR. 2006. Достижения в методах флуоресцентной дериватизации для высокоэффективного жидкостного хроматографического анализа углеводов гликопротеинов. Anal Biochem. 350:1-23).N-ацетилглюкозамин (GlcNAc) и N-ацетиллактозамин использовали в качестве акцепторов, а уридиндифосфат (UDP)-галактоза и цитидинмонофосфат (CMP)-N-ацетилнейраминовая кислота (NANA) использовали в качестве доноров для GalT-1 и ST-6 соответственно.Ферментативные продукты метили in situ АК и отделяли от субстратов на колонке TSKgel Amide 80 в нормально-фазовых условиях.Ферментные единицы определяли по площадям пиков путем сравнения с одновременно дериватизированными стандартами Gal-β1-4GlcNAc и NANA-α2-6 Gal-β1-4GlcNAc.Были установлены линейность (время и концентрация фермента), прецизионность (внутри и между анализами) и воспроизводимость анализов.Было обнаружено, что анализы полезны для мониторинга активности ферментов во время выделения и очистки.Анализы были высокочувствительными и работали так же или лучше, чем традиционные измерения радиоактивности на основе сахара.Формат анализа также можно использовать для измерения активности других трансфераз при условии, что акцепторы углеводов содержат восстанавливающий конец для мечения.Анализ акцепторов гликопротеинов был разработан с использованием IgG.Для разделения гликанов IgG (биантеннарные G0, G1, G2, моно- и дисиалилированные) был разработан короткий метод профилирования ВЭЖХ, который способствовал быстрому определению активности GalT-1 и ST-6.Кроме того, этот метод профилирования должен оказаться полезным для мониторинга изменений гликанов IgG в клинических условиях.