Продукты

Топологию мембран домена колицинового канала E1 изучали с помощью резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).FRET включает генетически кодируемую флуоресцентную аминокислоту (кумарин) в качестве донора и селективно меченый остаток цистеина, связанный с DABMI (4-(диметиламино)фенилазофенил-4'-малеимид) в качестве акцептора FRET.Остаток флуоресцентного кумарина был включен в белок посредством ортогональной пары тРНК/аминоацил-тРНК-синтетазы, что сделало возможным селективное включение в любой сайт внутри домена колицинового канала.Каждый вариант содержал стоп-мутацию (TAG) для включения кумарина и мутацию цистеина (TGT) для прикрепления DABMI.Шесть межспиральных расстояний внутри спиралей 1-6 определяли с использованием FRET-анализа как для растворимого, так и для связанного с мембраной состояния.Данные FRET показали большие изменения межспиральных расстояний среди спиралей 3-6 при ассоциации с мембраной, что дает новое представление о связанной с мембраной структуре домена канала.В целом межспиральная эффективность кумарин-DABMI FRET снижалась при связывании с мембраной, основываясь на зонтичной модели колицинового канала.Предварительная модель закрытого состояния домена канала была разработана на основе текущих и ранее опубликованных данных FRET.Модель предполагает круговое расположение спиралей 1-7 по часовой стрелке с внеклеточной стороны и межмембранную ассоциацию спиралей 1, 6, 7 и 10 вокруг центральной трансмембранной шпильки, образованной спиралями 8 и 9.